前置知識

通過病毒介導(dǎo)將核酸導(dǎo)入哺乳動物細胞是一種常用的實驗技術(shù)，被廣泛用于基因傳遞、基因表達和功能研究等領(lǐng)域。這個實驗通常分為以下6個部分：

1.選擇適當?shù)牟《据d體：常用的病毒載體包括腺病毒（Adenovirus）、腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）和逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）。

2. 構(gòu)建表達載體：將目標核酸（例如基因、RNA等）插入到病毒載體的適當位點上，構(gòu)建表達載體。這通常涉及將目標核酸序列克隆到適當?shù)谋磉_載體質(zhì)粒中，并進行驗證和測序。

3. 病毒包裝和擴增：將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)染到特定的包裝細胞中，這些細胞能夠產(chǎn)生具有完整病毒基因組的病毒顆粒。病毒顆粒可以通過細胞培養(yǎng)和病毒擴增過程進行大規(guī)模生產(chǎn)。

4.細胞轉(zhuǎn)染：將目標哺乳動物細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，然后將病毒顆粒加入培養(yǎng)基中與細胞進行共培養(yǎng)。病毒顆粒會與細胞表面的受體結(jié)合，并進入細胞內(nèi)部。

5.核酸導(dǎo)入和表達：一旦病毒進入細胞內(nèi)部，它會釋放出核酸負鏈，該負鏈會被細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制利用。目標核酸的表達產(chǎn)物（例如蛋白質(zhì)）會在細胞內(nèi)合成，并根據(jù)實驗需要發(fā)揮其功能。

6.實驗分析：根據(jù)實驗?zāi)康模梢詫毎捅磉_產(chǎn)物進行進一步的分析。這可能包括檢測蛋白質(zhì)表達水平、功能研究、細胞行為觀察等。

操作步驟

A 慢病毒制備：

1、提前一周復(fù)蘇293T細胞，使用10% FBS-DMEM培養(yǎng)基傳代3次以上。

轉(zhuǎn)染前一天將生長狀態(tài)良好的293T細胞用0.25%胰酶消化，得到細胞懸液，計數(shù)，然后進行慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，稀釋到10個/mL；

將293T接種到6孔板（每孔接種2 mL），使其密度為40%。

待其生長到孔板面積80-90%進行轉(zhuǎn)染。

2、通過質(zhì)粒大提獲得無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

3、在1.5mLEP管中分別加入150μL DMEM培養(yǎng)基、15μL lipofectamine 2000。

4、在1.5 mL EP 管中分別加入700μL DMEM培養(yǎng)基、7μg目的DNA、5.25μg的psPAX2、1.75μg的pCMV-VSVG（使三條質(zhì)粒質(zhì)量比為 4:3:1）。

5、將等體積的質(zhì)粒混合物加入到轉(zhuǎn)染試劑混合物中，室溫靜置5min。

6、將隔夜培養(yǎng)的6孔板中培養(yǎng)基小心吸出，替換為新鮮DMEM（血清）細胞培養(yǎng)基。每個孔中加入300 μL的DNA-lipo 2000復(fù)合物。

7、分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h，收集六孔板中病毒上清液，經(jīng)0.45μm的濾膜過濾或離心去除細胞碎片（短期內(nèi)可放于4℃保存，長期保存于-80℃冰箱，勿反復(fù)凍融）。

B 慢病毒感染：

1、提前一周復(fù)蘇靶細胞，傳代三次以上保證細胞生長狀態(tài)良好。病毒感染前一天將靶細胞傳代到6孔板，使細胞生長密度為約20%。

2、待細胞生長至孔板面積50-60%時，加入2ml病毒液，加入polybrene,并補加0.5ml（血清）細胞培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)24h。

3、用（血清）細胞培養(yǎng)基更換病毒液，恒溫培養(yǎng)24h。

4、加入適量的抗生素篩選，每次換液時補加抗生素，至靶細胞細胞無明顯死亡。

注意事項：

1.選擇合適的載體和元件：根據(jù)實驗需要選擇適當?shù)馁|(zhì)粒載體和啟動子，例如CMV啟動子、SV40啟動子等。

2. 細胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)染密度：細胞狀態(tài)好，且處于指數(shù)生長階段。靶細胞密度不宜過高或過低，建議將細胞密度控制在指數(shù)期的70-80%；

3. 選擇合適轉(zhuǎn)染試劑、比例和轉(zhuǎn)染時間：選擇適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑，不同類型的細胞和外源DNA可能需要使用不同的試劑進行轉(zhuǎn)染；

同時，還需要對慢病毒質(zhì)粒、DNA和轉(zhuǎn)染試劑的比例、轉(zhuǎn)染時間進行優(yōu)化。可在感染靶細胞時加入適量的聚凝胺提高轉(zhuǎn)染效率。

4.抗生素濃度：可在轉(zhuǎn)染前做MTT實驗探究其工作濃度，選取合適的篩選濃度使轉(zhuǎn)染的細胞能夠存活并形成穩(wěn)定的細胞系。

5.篩選時間：在進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗時，需要進行足夠長的篩選時間以檢測出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，轉(zhuǎn)染后可通過WB，流式細胞術(shù)，Dot blot等方法驗證。

6．對照組設(shè)置：設(shè)置陽性和陰性對照以評估轉(zhuǎn)染效果和篩選是否成功。

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