H1人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)

1.試劑和材料

H1細(xì)胞專用培養(yǎng)基試劑

所需的其它試劑和材料

2.培養(yǎng)流程

2.1試劑的制備

2.1.1 培養(yǎng)基的制備

2.1.1在室溫（15-25℃）或冰箱內(nèi)（2-8℃）過夜解凍細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑，可在無菌條件下將添加劑分裝為適量的工作等份，并在-20℃下凍存。冷凍的分量須在3個月內(nèi)用完。解凍后的分量應(yīng)該一天內(nèi)制備成專用培養(yǎng)基。請勿在解凍后再次冷凍。

2.1.2.在無菌條件下將20mL的添加劑全部解凍后加入到500mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分混勻。專用培養(yǎng)基在（2-8℃）下儲存時刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多2-3周，或在-20℃下冷凍時刻維持穩(wěn)定狀態(tài)最多3個月。在室溫（15-25℃）或冰箱內(nèi)（2-8℃）過夜解凍冷凍的培養(yǎng)基，不要長時間放在37℃水浴內(nèi)加熱培養(yǎng)基。

如果在無菌條件下制備，細(xì)胞專用培養(yǎng)基可直接使用。

2.1.2 Matrigel工作液的配制與包被

鑒于基質(zhì)膠的操作環(huán)境要求比較嚴(yán)格，為保證您的實驗順利，特此對以下幾個方面進行溫馨提示：

1. 收貨時，首先確認(rèn)還有干冰，Matrigel成固態(tài)，液面水平，如有異常請及時拍照取證并聯(lián)系我們。

2. 整個Matrigel只能分裝一次，在分裝前，要先放4℃冰箱（最好先把Matrigel插在冰上，然后放入4℃冰箱）過夜，且分裝用的槍頭、EP管等都要提前-20℃預(yù)冷（基質(zhì)膠在10℃以上會發(fā)成膠凝固導(dǎo)致基質(zhì)膠報廢），整個分裝過程都需在冰上進行，且以后每次試驗時拿出本次用量所需的基質(zhì)膠。

3. 實驗人員手心不要接觸基質(zhì)膠，如：要手持裝有Matrigel的EP管的上方，防止體溫使基質(zhì)膠成膠凝固。 

4. Matrigel的稀釋比例建議為100倍稀釋。

本庫建議的配制Matrigel工作液方法：

1. 稀釋前將Matrigel放入4℃冰箱過夜融化。

2. 將適量體積的稀釋液（DMEM/F12或PBS）置4℃冰箱預(yù)冷。

3. 將融化的Matrigel與稀釋液從冰箱中取出并打開蓋子，用移液管吹吸稀釋液幾次以冷卻移液管，并吸取少量稀釋液加入Matrigel管中混勻，將Matrigel轉(zhuǎn)移到稀釋液中，并吹打混勻。（因為Matrigel遇15℃以上溫度就會成凝膠粘在原裝玻璃壁和移液管壁上，故Matrigel從冰箱拿出來以后盡快打開蓋子并轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的稀釋液中，吸取Matrigel的移液管一定要冷卻）。

4. 立即用稀釋后的Matrigel包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿。對于6孔板，每個孔使用1mL稀釋后的Matrigel，對于6cm的培養(yǎng)皿，每個孔使用2mL稀釋后的Matrigel，晃動培養(yǎng)板使Matrigel溶液均勻的分布在表面上。

5. 使用前，包被的培養(yǎng)板應(yīng)放在培養(yǎng)箱（37℃）下至少1h。請勿讓培養(yǎng)板脫水。在培養(yǎng)板可供使用之前，請勿移除Matrigel溶液。

如果不立即使用，培養(yǎng)板必須密封，以防止脫水。包被后的培養(yǎng)板可在2-8℃下最多儲存7天。

如果Matrigel溶液并未全覆蓋表面，則無法實驗最佳的細(xì)胞培養(yǎng)，因此，不建議使用含有溶液已蒸發(fā)區(qū)域的培養(yǎng)板。

如果已將培養(yǎng)板在2-8℃下儲存，則在移除Matrigel溶液之前，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱（37℃）下放置30min。

2.1.3 Y27632的配制

Y27632粉末溶解在PBS中，配制成濃度未10mM的儲存液，0.22μm濾膜過濾除菌。分裝后冷凍于-20℃。

Y27632提高復(fù)蘇和傳代后的克隆形成率，所以只在復(fù)蘇和傳代步驟添加（1:1000，即終濃度為10μM），換液時不添加。

2.2.復(fù)蘇

在開始復(fù)蘇前，將所有試管、預(yù)熱后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿準(zhǔn)備好，已確保盡快完成復(fù)蘇過程。

1. 將凍存管從液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解凍，輕柔持續(xù)地?fù)u動凍存管，直到只剩下一個小冷凍團。從水浴槽取出凍存管，70%乙醇擦拭進行消毒。

2. 使用移液管將凍存管中含有H1細(xì)胞的凍存液輕輕轉(zhuǎn)移至一個含有5-6mL已經(jīng)預(yù)熱的專用培養(yǎng)基的15mL離心管中，過程必須輕柔防止吹散細(xì)胞團。

3. 室溫300g離心5min。

4. 吸出培養(yǎng)基，確保細(xì)胞團完整。

5. 然后緩慢加入1mL專用培養(yǎng)基，用手指輕彈離心管底部，使細(xì)胞團脫離底部并分散。

6. 輕輕的將此1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至已包被的培養(yǎng)皿/板/瓶，根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積，加入ROCK inhibitor Y27632，終濃度為10μM。

7. 將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加Y27632，但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱）。

2.3.傳代

當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮（對比邊緣），相鄰的集落開始融合時，此時可進行傳代。

1. 傳代前，準(zhǔn)備 37 ℃預(yù)熱好的無鈣鎂 PBS 溶液及消化液，專用培養(yǎng)基。

2. 吸走上清，并加入 37℃預(yù)熱好的 PBS 溶液清洗1次。

3. 加入適量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃預(yù)熱好的消化液。

4. 37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團脫落。

5. 加入適量的專用培養(yǎng)基終止消化。

6. 移入離心管，300g離心5min。

7. 離心后重懸（重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步）。

8. 傳代比例為 1：6—1：8，根據(jù)最終培養(yǎng)細(xì)胞的液體體積，加入ROCK inhibitor Y27632，終濃度為10μM。

9. 將培養(yǎng)皿/板/瓶置于37℃培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基（換液不需要再添加Y27632，但培養(yǎng)基需提前預(yù)熱）。

2.4.凍存

當(dāng)集落變得較大、中心變得密集、明亮（對比邊緣），相鄰的集落開始融合時，此時可進行傳代。

1. 傳代前，準(zhǔn)備 37 ℃預(yù)熱好的無鈣鎂 PBS 溶液及消化液，專用培養(yǎng)基。

2. 吸走上清，并加入 37℃預(yù)熱好的 PBS 溶液清洗1次。

3. 加入適量（按 6 孔板每孔加 1mL，6cm 皿加 2mL，10cm 皿加 3mL 的量）的 37℃預(yù)熱好的消化液。

4. 37℃放置1-2min，用手指輕彈皿/板/瓶身，顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣開始脫離培養(yǎng)皿/板底，克隆內(nèi)部大部分細(xì)胞成團脫落。

5. 加入適量的專用培養(yǎng)基終止消化。

6. 移入離心管，300g離心5min。

7. 離心后重懸（重懸步驟參照復(fù)蘇4-5步）。

8. 使用預(yù)冷的凍存液輕輕的重懸細(xì)胞團，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管，凍存按 6 孔板每孔凍 1 支，6cm 皿凍 2-4 支，10cm 皿凍 6-12 支。

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