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細胞培養技術
發布時間： 2021-10-29 點擊次數： 1760次簡介一.細胞培養的基本原理細胞培養是用酶消化法將組織碎塊分離成單個細胞，用培養基制成細胞懸液，在體外適宜條件下，使細胞生長繁殖，并保留其一定的結構和功能特性。細胞培養與組織培養、器官培養主要不同點在于原始培養的對象不同。細胞培養使用的是單個細胞懸液，組織培養使用的是組織塊(0．5～1立方毫米)或薄片(厚0．2毫米)，而器官培養使用的是器官原基或器官的一部分或整個器官。在組織培養中，細胞自組織塊周圍移出并生長，細胞在生長過程中總有移動(運動)或其它變動，這樣就使被培養的組織難以長期維持其原有的結構和功能。培養時間越長，發生變化的可能性越大，結果常使單一類型的細胞保存下來，最終成了細胞培養。在細胞培養中，細胞生命活動和體內細胞一樣，仍然是相互依存的，呈現一定的組織特異性，所以組織培養和細胞培養實際上無嚴格區別。
細胞培養技術是生命科學中常用的研究手段，該方法能排除神經體液因素的影響及肝、腎解毒功能的干擾，觀察某些因素或藥物對培養細胞的直接作用。通過實驗可獲得某一類型細胞的純培養。如心肌組織中心肌細胞約占50％，非心肌細胞占50％；而經純化分離的心肌細胞懸液中，心肌細胞可達95％以上，這樣，心肌細胞原代培養實驗基本不受其它細胞的干擾。在細胞培養實驗中能直接觀察到培養細胞生命活動的動態過程；用定時顯微攝影記錄可發現一些肉眼觀察不到的生命現象；還可利用電鏡手段、同位素標記、放免法和免疫組化法等來研究細胞形態結構及細胞內化學物質的分布。此外，還能節約研究費用。如在某些研究中，用100只動物做實驗所獲得結論與用100張蓋玻片或幾十個培養瓶而獲得結論具有相同的統計學意義，而細胞培養較之大批量的動物飼養花費要小。
但細胞培養方法也存在不足之處：培養細胞失去體內細胞的制約和整體的調節作用，細胞形態和功能會發生一定程度的改變。培養方法、實驗試劑對細胞形態和功能有一定的影響，如胰蛋白酶可破壞細胞表面受體、酶、抗原等。長期體外培養的細胞，由于反復傳代、凍存和操作等因素的影響，可能發生染色體非整倍體改變，呈永生化或癌變的特征。
材料與儀器二.細胞培養的基本設備與用品(1)細胞培養的基本設備細胞培養的基本設備有：CO2培養箱，倒置顯微鏡，凈化臺，壓力蒸汽消毒器，自動雙重純水蒸餾器，液氮罐，冰箱，電熱干燥箱，電熱恒溫培養箱，電動吸引器，抽氣泵等。
(2)常用的實驗用品
1.玻璃器皿
細胞培養所用的玻璃器皿應由透明度好、無毒的中性硬質玻璃制成。常用的有以下幾種：國產螺旋口培養瓶[有12．5毫升，25毫升，100毫升等規格，國外培養瓶常以底面積(平方厘米)表示]；培養皿(直徑有3．5厘米，6厘米，9厘米，10厘米等規格)；離心管(5毫升，10毫升)；注射器(1毫升，5毫升等)；用生理鹽水瓶代替的貯存瓶(100毫升，250毫升，500 毫升)；青霉素瓶(5毫升)；西力辛瓶(10毫升)；其它還有尖吸管和移液管，載玻片(厚度0．8～1．2毫米)，蓋玻片(厚度0．12毫米)，貯存尖吸筒用的玻璃筒或金屬筒，漏斗，燒杯，量筒，貯蒸餾水瓶，冷凍管(1．5毫升，2毫升)等。
2.塑料品
多孔培養板規格有4、6、12、24、96孔等，培養皿直徑有3厘米、6厘米、10厘米等。塑料品經消毒滅菌密封包裝，供一次性使用，重復使用的需經特殊方法清洗消毒。塑料器材厚薄均勻，有的表面經特殊處理，細胞易于生長。
3.器械
解剖刀、眼科剪和鑷(直頭和彎頭)、中號圓頭鑷、止血鉗等。
4.雜用品
金屬飯盒、試管架、各種規格膠塞、記號筆、搪瓷盤、吸頭(吸取液體的膠帽)、酒精燈、酒精、火柴、碘酒棉球瓶等。
組織培養中使用最多的是吸管、培養瓶、培養皿及各種瓶塞。實驗者手中應有三套器材，瓶塞數要大于瓶數，才能保證實驗中的循環使用。
實驗步驟三.細胞培養用品的清洗與消毒滅菌(1)清 洗1.常用玻璃器皿清洗
◇清洗要領
浸泡
初次使用的玻璃器皿呈堿性，表面常附有灰塵和一些對細胞有毒的物質，如鋁和砷等。空氣濕度高時，玻璃器皿表面又易長霉。使用前，新器皿浸泡在5％稀鹽酸中過夜，以中和玻璃表面的堿性物質并去除霉斑；然后經簡單刷洗，流水沖洗(逐片進行)，蒸餾水浸泡，干燥備用。新玻片處理后，短時間不用時，需將它投入95％的酒精中保存，以防玻片長霉。培養后的玻璃器皿應立即投入清水中浸泡，器皿中殘留的細胞、蛋白質一旦干涸，即固著于玻璃表面，極難脫落。
刷洗
用過的玻璃器材經自來水沖洗后，浸入水中煮沸，然后將適量洗滌劑(洗潔精或洗衣粉)投入沸水中繼續煮沸10分鐘，趁熱刷洗器皿內外，刷洗后浸入清水中進行沖洗。
酸泡
刷洗好的玻璃器材干燥后置清潔液中浸泡24小時，清潔液的強氧化作用可清除刷洗不掉的極微量雜質。
◇清洗步驟
玻璃器材煮沸10分鐘→刷洗→流水振蕩沖洗15-20遍→50℃烤干→清潔液浸泡24小時→流水振蕩后沖洗15-20遍→漓水→蒸餾水浸泡2次(每次24小時)→50℃烤干，待包裝。
◇清洗注意事項和要求
①使用后的實驗器材應立即投入清水中。
②浸泡、煮沸、酸泡的器皿內要充滿液體，不得有氣泡。
③刷洗、酸泡后的器材要用流水振蕩沖洗，不得殘留洗滌劑、清潔液。方法是：每瓶灌2／3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復15―20次(尖滴管置量杯中沖洗)。
④煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑(直徑35厘米的鋁鍋，用洗衣粉10克左右)。若洗滌劑和實驗器材同時從冷水煮至沸騰或使用過量洗劑，均易腐蝕玻璃表面，使玻璃堿化，pH值上升。
⑤軟毛刷的刷端已掉毛的應該棄去，否則會損害玻璃。玻璃劃痕處易殘留洗滌劑，會改變培養液pH值和毒害細胞。
⑥清潔物品應及時包裝消毒，應注意妥善保存，防止落入灰塵、蟑螂、螞蟻等引起二次污染。
⑦使用后的膠塞與玻璃器材同時煮洗時，膠塞要放在煮鍋的底部。
⑧浸泡器材的蒸餾水容器要專用，并做好標記，如“蒸餾水Ⅰ盆"、“蒸餾水Ⅱ盆"。
⑨器材清洗干燥后，在以后各步操作時，手指不可接觸器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套進行操作，省時又保證清洗質量。
⑩用超聲波儀清洗器材時，清洗要求同上。
2.橡膠制品的清洗
新購置的橡膠制品(膠塞、膠管、橡皮乳頭)的洗滌方法如下：0．5摩爾/升NaOH煮沸15分鐘→流水沖洗→0．5摩爾/升HCl煮沸15分鐘→流水沖洗→自來水煮沸2次→蒸餾水煮沸20分鐘→50℃烤干備用。這樣處理可*除凈膠塞上的硫磺等有毒物質。用過的膠塞，其清洗方法、要求基本同玻璃器材。因膠塞使用面常沾有洗滌劑，流水沖不凈，故膠塞洗刷的重點部位是膠塞使用面，用刷逐個刷洗。在使用過程中，膠塞不能與培養液接觸，以防未洗凈的膠塞污染培養液和細胞。
3．G6除菌濾器的清洗
新G6除菌濾器置玻璃洗液中浸泡24小時，流水緩慢沖洗，至pH值為5．5左右，然后用4倍的蒸餾水緩慢沖洗，再用重蒸餾水緩慢沖洗，烤干，包裝消毒備用。用過的G6除菌漏斗立即浸泡水中(注意：濾器千萬不能干涸)過夜，流水緩慢沖洗24小時或更長時間，至濾面基本疏通時，50℃烤干，濾器再置清潔液中浸泡24小時，或裝滿清潔液自然過濾。流水沖洗及其后的處理同新G6除菌濾器。
4.正壓除菌濾器的清洗
新的或使用后的正壓濾器經稀洗滌劑刷洗一次流水沖洗15分鐘→漓水→去離子水浸泡24小時→三蒸水浸泡24小時→干燥備用。
5.塑料制品的清洗
塑料制品質地軟且耐腐蝕能力強，但不耐熱，易出現劃痕。其清洗程序為：器皿用后立即用流水沖洗→浸于自來水中過夜→用紗布、棉簽和50℃稀洗液刷洗→流水沖洗(人工沖洗15―20遍)→晾干→浸于清潔液中15分鐘→流水沖洗→蒸餾水浸泡兩次(每次24小時)→晾干備用。
6.清洗液的配制
清潔液
新配制的清潔液為棕紅色，遇有機溶劑或水分增多時變成綠色，表明失效。
先在搪瓷盆中加入蒸餾水，加熱溶解重鉻酸鉀，再將盆置流 動自來水中，待重鉻酸鉀液冷卻后，緩慢加入濃硫酸，邊加邊用玻棒攪動，以混合液溫度不過快上升和不出現重鉻酸鉀結晶為度。
玻璃濾器洗液
取10克硝酸鈉和28．6毫升濃硫酸，放入盛有470毫升蒸餾水的玻璃缸內混勻備用。
清潔液配方⑤加熱前將放氣閥摘子置垂直位(開放)，消毒器內空氣隨溫度升高由此閥孔逸出，容器內冷空氣隨之排出。當水煮沸時，有一股較急的蒸汽沖出時，將放氣閥摘子置水平位(關閉)。排除冷空氣的另一種方法是：放氣閥摘子置水平位(關閉)，加熱，壓力升至5磅時，將摘子置垂直位(開放)，冷、熱空氣先后排出(可用手試)。待壓力指針回歸零位時，放氣閥摘子再置水平位(關閉)。⑥繼續加熱，當消毒器內升壓至需要壓力時，計時并使壓力恒定。壓力維持方法：用電加熱時，可通過電源和滅菌器間的穩壓器調節；沒有穩壓器時，用放氣閥摘子自動排氣調節；用煤氣加熱時，可調節火力維持壓力。根據消毒物品種類不同所選擇的消毒壓力和時間也不同，一般物品(如布類、金屬器械、玻璃器皿等)消毒的要求是15磅20分鐘；橡膠制品為10磅10分鐘；常規液體消毒15磅15分鐘。一般認為在這種壓力下1分鐘內幾乎可殺死所有微生物，但由于消毒物品的包裝內仍可能留有冷空氣，而使高壓蒸汽不能達到消毒器的各部分，所以要延長消毒時間。
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